產(chǎn)品展示PRODUCTS
KO first小鼠模型構(gòu)建
更新時間：2025-06-26
訪問量：18
廠商性質(zhì)：其他
KO first小鼠模型構(gòu)建
一、KO-first 載體設(shè)計原理
KO-first載體通過精巧的基因陷阱（Gene Trap）和條件性模塊設(shè)計，實現(xiàn)"三位一體"功能：
野生型基因
KO-first等位基因
傳統(tǒng)KO
條件性KO
報告基因過表達
核心元件：
5'同源臂（1.5-3 kb）
SA-βgeo-pA（剪接受體-β半乳糖苷酶/新mei素抗性融合基因）
floxed 關(guān)鍵外顯子（通常第2-4號外顯子）
3'同源臂（1.5-3 kb）
FRT-flanked NeoR（用于陽性篩選，后續(xù)可切除）
二、KO first小鼠模型構(gòu)建流程（以ES細(xì)胞同源重組為例）
1. 靶向載體構(gòu)建
設(shè)計要點：
關(guān)鍵外顯子兩側(cè)插入loxP位點（間距通常1-2 kb）
在5'UTR插入SA-βgeo實現(xiàn)基因陷阱（組成型KO）
NeoR兩側(cè)加入FRT位點便于后續(xù)Flp刪除
改造
野生型基因: Exon1-Exon2-Exon3
KO-first等位基因: SA-βgeo-loxP-Exon2-loxP-FRT-NeoR-FRT
2. ES細(xì)胞打靶
電轉(zhuǎn)與篩選：
線性化載體電轉(zhuǎn)至JM8A3.N1等ES細(xì)胞
G418（NeoR）陽性篩選7-10天
克隆驗證：
5'端PCR：F1（同源臂外側(cè)） + R1（βgeo內(nèi)）
3'端PCR：F2（NeoR內(nèi)） + R2（同源臂外側(cè)）
Southern blot確認(rèn)單拷貝整合
3. 獲得嵌合體小鼠
囊胚注射：將陽性ES細(xì)胞注入C57BL/6N囊胚
嵌合體鑒定：毛色嵌合（129Sv ES細(xì)胞→B6背景）
4. 傳代與品系建立
第一步交配：嵌合體（公鼠）× WT（母鼠）
獲得F1代（SA-βgeo-loxP-Exon2-loxP，NeoR+）
第二步交配：F1 × Flp deleter小鼠（刪除NeoR）
獲得"clean" KO-first小鼠（僅保留SA-βgeo和loxP）
三、三種應(yīng)用模式切換
1. 傳統(tǒng)KO（組成型敲除）
機制：SA-βgeo阻斷基因轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致功能wan全喪失
驗證方法：
β-gal染色（報告基因表達）
Western blot檢測目標(biāo)蛋白缺失
2. 條件性KO（組織特異性敲除）
交配策略：
× Cre
KO-first
cKO
關(guān)鍵點：
Cre介導(dǎo)的loxP重組刪除floxed外顯子
需驗證目標(biāo)組織中的敲除效率（qPCR/免疫組化）
3. 報告基因過表達
利用SA-βgeo：
β-gal活性反映內(nèi)源基因表達模式
可用于細(xì)胞譜系追蹤
4. 恢復(fù)野生型（可選）
與Flp deleter小鼠交配可刪除SA-βgeo，恢復(fù)野生型等位基因
四、技術(shù)優(yōu)勢與局限性
優(yōu)勢 | 挑戰(zhàn) |
一個模型實現(xiàn)三種功能 | 載體構(gòu)建復(fù)雜（需專業(yè)設(shè)計） |
避免多品系重復(fù)構(gòu)建 | ES細(xì)胞打靶周期長（6-12個月） |
國際標(biāo)準(zhǔn)化（IKMC資源可獲取） | βgeo可能影響鄰近基因表達 |
五、關(guān)鍵優(yōu)化策略
外顯子選擇：
優(yōu)先選擇編碼關(guān)鍵功能域的外顯子
確保刪除后引起移碼突變（如外顯子2/3）
減少背景干擾：
使用自我刪除型NeoR（如neo-DTA）
選擇高重組效率ES細(xì)胞系（如JM8A3.N1）
表型分析對照：
必須包括：WT、KO-first純合子、KO-first × Cre
六、經(jīng)典應(yīng)用案例
Tsc1 KO-first模型：
傳統(tǒng)KO：胚胎致死（研究發(fā)育功能）
Nestin-Cre cKO：神經(jīng)發(fā)育缺陷
β-gal報告基因：揭示Tsc1在腦區(qū)的表達模式
p53 KO-first模型：
傳統(tǒng)KO：自發(fā)腫瘤表型
K14-Cre cKO：研究皮膚特異性腫瘤發(fā)生
