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cKO小鼠模型構(gòu)建

cKO小鼠模型構(gòu)建

簡(jiǎn)要描述:
cKO小鼠模型構(gòu)建:條件性敲除(Conditional Knockout, cKO)小鼠通過(guò)在特定組織或發(fā)育階段刪除目標(biāo)基因,避免全身性敲除導(dǎo)致的致死性,是研究基因時(shí)空特異性功能的黃金標(biāo)準(zhǔn)

更新時(shí)間:2025-06-26

訪問(wèn)量:21

廠商性質(zhì):其他

一、cKO小鼠模型構(gòu)建技術(shù)路線選擇

方法

周期

適用場(chǎng)景

關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)

CRISPR-Cas9 + HDR

3-6個(gè)月

快速構(gòu)建floxed小鼠

無(wú)需ES細(xì)胞,直接受精卵操作

ES細(xì)胞同源重組

8-12個(gè)月

復(fù)雜設(shè)計(jì)(如大片段floxed

精準(zhǔn)度高,適合商業(yè)化品系開發(fā)

Cre-loxP系統(tǒng)

需兩代交配

組織特異性/誘導(dǎo)型敲除

時(shí)空可控性z強(qiáng)




二、cKO小鼠模型構(gòu)建核心步驟詳解

1. 靶向策略設(shè)計(jì)

  • loxP位點(diǎn)插入

    • 選擇關(guān)鍵外顯子(通常第2-4號(hào)外顯子),兩側(cè)插入loxP序列(34 bp)。

    • 設(shè)計(jì)原則:刪除后導(dǎo)致移碼突變或功能域缺失(需蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè))。

  • 避免干擾:確保loxP不破壞相鄰基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子。

2. 打靶載體構(gòu)建(以ES細(xì)胞法為例)

5'同源臂 1.5-3kb

loxP

目標(biāo)外顯子

loxP

3'同源臂 1.5-3kb

NeoR篩選標(biāo)記

DTA負(fù)選標(biāo)記

3. 基因修飾小鼠制備

  • CRISPR

    • 注射混合物:Cas9 mRNA + 2sgRNA(靶向loxP插入位點(diǎn)) + ssDNA供體(含loxP序列)。

    • 優(yōu)化要點(diǎn):使用化學(xué)修飾的ssDNA供體提高HDR效率(如IDTUltramer)。

  • ES細(xì)胞法

    • 通過(guò)電轉(zhuǎn)將線性化載體轉(zhuǎn)入ES細(xì)胞,G418篩選后PCR驗(yàn)證正確重組克隆。

4. floxed小鼠鑒定

  • 基因型檢測(cè)

    • 引物設(shè)計(jì)

      • F1: 5'-同源臂外側(cè)

      • R1: loxP序列內(nèi)側(cè)

      • 預(yù)期條帶:野生型(無(wú)loxP)和floxed(有loxP)差異≥100 bp

    • 測(cè)序驗(yàn)證:確保loxP方向正確(正向重復(fù))。

5. Cre小鼠交配

  • Cre品系選擇

Cre類型

代表品系

應(yīng)用

組織特異性

Alb-Cre(肝臟)

代謝研究


Nestin-Cre(神經(jīng)系統(tǒng))

神經(jīng)發(fā)育

誘導(dǎo)型

CAG-CreERT2(全身誘導(dǎo))

他mo昔芬給藥后敲除

發(fā)育階段特異性

Sox2-Cre(早期胚胎)

胚胎致死基因研究

  • 交配策略

自交

floxed/floxed

Cre陽(yáng)性

F1: floxed/+ Cre+

F2: floxed/floxed Cre+

6. 敲除效率驗(yàn)證

  • qPCR/WB:比較Cre陽(yáng)性和陰性組織的基因表達(dá)。

  • 報(bào)告基因:若設(shè)計(jì)時(shí)引入tdTomato等,可直接熒光觀察。




三、常見問(wèn)題解決方案

問(wèn)題

原因

優(yōu)化策略

loxP重組失敗

同源臂太短或HDR效率低

延長(zhǎng)同源臂至2 kb,使用HDR增強(qiáng)劑(如Rad51

背景敲除

Cre滲漏表達(dá)

選擇低滲漏Cre品系(如CreERT2

表型不一致

遺傳背景混雜

回交至純合背景(>N6




四、x技術(shù)升級(jí)

  • loxP系統(tǒng)(如lox2272:實(shí)現(xiàn)可逆敲除,避免傳統(tǒng)loxP的不可逆性。

  • CRISPR-Cas9 + 轉(zhuǎn)座子:通過(guò)PB轉(zhuǎn)座子攜帶loxP,提高插入效率(適合難靶向位點(diǎn))。

 


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